普通高等教育"十二五"规划教材:生物化学与分子生物学实验技术.pdf

普通高等教育
 

书籍描述

内容简介
本书由实验和附录两部分组成。实验部分着重介绍了37个综合性、实用性强的生物类实验,分为生物化学实验和分子生物学实验两大部分。本教材凝聚了资深教师数十年实验教学的经验和体会,实验的设计和操作更为科学、严谨,更易于学生学习掌握。本版教材在前两版内容的基础上,对每一实验都增加了详细的实验操作技术指导,在实验教学中获得了良好效果。
在附录中整理和翻译了有关“常用仪器性能指标及使用说明”、“常用缓冲溶液的配制”、“植物样品的采集、处理与保存”等内容。此外,还补充了一些生化实验方面的习题。
本教材可供理工科高等院校的生命科学、生物技术、生物工程及农林院校的农学、林学、植保、资源环境、园艺、食品、理学等各专业的学生及相关领域的科技人员使用。

编辑推荐
《普通高等教育"十二五"规划教材:生物化学与分子生物学实验技术(第3版)》可供理工科高等院校的生命科学、生物技术、生物工程及农林院校的农学、林学、植保、资源环境、园艺、食品、理学等各专业的学生及相关领域的科技人员使用。

目录
实验室规则1
实验记录及实验报告2
生物化学实验4
实验一缓冲液配制和pH值测定4
实验二分光光度计线性分辨范围测定6
实验三3,5—二硝基水杨酸比色法测定糖的含量8
实验四RNA的提取与核酸的颜色反应14
实验五影响淀粉酶活性的一些因素18
实验六硫酸铵沉降法纯化工业淀粉酶22
实验七葡聚糖凝胶色谱法脱盐24
实验八淀粉酶活力的测定28
实验九Folin—酚比色法测定蛋白质含量31
实验十间隔法测定过氧化物酶的活力35
实验十一连续记录法测定过氧化氢酶的活力37
实验十二2,6—二氯酚靛酚滴定法测定L—抗坏血酸的含量39
实验十三荧光光度法测定核黄素的含量42
实验十四茚三酮比色法测定赖氨酸含量45
实验十五考马斯亮蓝G—250比色法测定蛋白质含量48
实验十六纸电泳分离鉴定三种腺苷酸52
实验十七醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白53
实验十八NBT光化还原法测定超氧化物歧化酶活性56
实验十九Eadie—Hofstee法测定辣根过氧化物酶的Km58
实验二十硫酸铵分级沉淀纯化苯丙氨酸解氨酶60
实验二十一凝胶色谱法脱去PAL溶液中的硫酸铵66
实验二十二DEAE纤维素柱色谱法纯化PAL70
实验二十三超氧化物歧化酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳72
实验二十四过氧化物酶同工酶的分析——等电聚焦电泳76
实验二十五过氧化氢酶和辣根过氧化物酶的色谱分离与电泳80
实验二十六1,5—二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶提取及其Western杂交检测84
分子生物学实验88
实验二十七用16SrDNA方法鉴定细菌种属88
实验二十八植物基因组DNA的提取、纯化与定量90
实验二十九DNA琼脂糖凝胶电泳93
实验三十基因组DNA的酶切与检测95
实验三十一质粒DNA的提取、纯化与鉴定96
实验三十二目的基因PCR扩增99
实验三十三感受态细胞的制备及转化101
实验三十四DNA测序103
实验三十五重组子的构建、筛选与鉴定105
实验三十六植物总RNA的提取、纯化与检测109
自行设计实验111
实验三十七工业淀粉酶的纯化与分析111
综合性开放实验112
附录113
附录一植物样品的采取、处理与保存113
附录二常用缓冲溶液的配制115
附录三硫酸铵溶液饱和度计算表(0℃)122
附录四色谱显色剂123
附录五常用凝胶及色谱用滤纸的规格和性能127
附录六玻璃仪器的洗涤及一些常用洗涤剂129
附录七移液器的使用131
附录八分光光度计132
附录九离心机140
附录十电泳设备144
附录十一pH计148
附录十二电子天平150
附录十三EDC—810型PCR仪150
附录十四实验室安全及防护知识152
生物化学实验习题155
生物化学实验习题参考答案170

序言
前言

生物化学实验是生命科学研究的重要手段。学生通过生物化学实验课程的学习,可加深对实验原理的理解、巩固理论知识、掌握生物化学实验的技术、熟悉实验室常用仪器和一些大型精密仪器的使用,从而为以后的专业课学习以及生产、科研工作打下一个良好的基础。
《生物化学与分子生物学实验技术》(第三版)是在前两版教材的基础上,进一步结合我校生物学教学实验中心资深教师的实践教学经验,对原教材做了大量修正编写而成的。本版教材更加注重培养学生在定量、定性实验操作中的科学性、严谨性。通过本课程的学习,可以培养学生分析问题、解决问题的能力,激发学生对科学实验的兴趣。
为了使学生通过有限的实验课程学到更多的实验技能,在将来的工作或科研中少走弯路,编者将几十年实验教学的经验和体会融入了本教材。本书会让学生对实验过程中的每一步骤怎样操作、为什么这样操作,有一个较为清晰的理解。本书对学生以及科研工作者都是一本有益的工具书。
本教材内容包括蛋白质、糖类、脂类、核酸、氨基酸、酶和维生素的提取、分离、电泳、色谱、光谱法检测及分子杂交等定性定量技术。本教材的每个实验后面都附有思考题及答案,便于学生和研究人员在学习和科研中参考。本书可供理工科高等院校的生命科学、生物技术、生物工程及农林院校的农学、林学、植保、资源环境、园艺、食品、理学等各专业的本科生使用,可以作为“生物化学实验”、“分子生物学实验”等课程的教材和参考书。
本教材的出版得到了南京农业大学的苏业瑜、叶茂炳、徐朗莱等教授以及生命科学院领导、实验教学中心领导的大力支持和帮助;生物基地51班的张亮、齐继艳、陈舟舟和生命基地62班的张艳红同学以及生物基地91班的牟尚婕、牛静、龙若吟、朱非凡等同学对部分实验内容进行了探究、改进与验证,谨此深表谢意!
鉴于作者水平有限,书中不足之处,欢迎广大师生提出宝贵意见。

编者
南京农业大学

第二版前言

生物化学与分子生物学实验技术是生物化学的重要内容,也是生物科学研究的重要方法和手段。学生通过生物化学与分子生物学实验,理解实验原理,进一步巩固生物化学与分子生物学的理论知识,并且掌握生物化学与分子生物学实验的基本方法和技术,熟悉实验室常用仪器和一些大型精密仪器的使用,从而为以后的专业课学习以及生产、科研工作打下一个良好的基础。
《生物化学与分子生物学实验》一书是在第一版《生物化学实验》的基础上,结合本校多年的实验教学经验和广大师生的建议,对原教材做了必要的修改。增添了一些新的实验内容、习题及答案。在附录中整理和翻译了“常用仪器性能指标及使用说明”、“缓冲溶液的配制”、“植物样品的采集、处理及保存”等资料。本教材包括蛋白类、糖类、脂类、核酸、氨基酸、酶和维生素的提取、分离、电泳、层析、光谱法检测及分子杂交等定性定量技术,以锻炼学生的基本实验技能,同时培养学生综合实验、设计实验的创新能力。
本书可供理工科高等院校的生物科学、生物技术、生物工程及农林院校的农学、林学、植保、资环、园艺、食品、理学等各专业的本科生使用。可以作为《生物化学实验》、《生物化学分析》、《分子生物学实验》等课程的教材和参考书。
本教材多年来得到了南京农业大学的苏业瑜、叶茂炳、徐朗莱等教授以及生命科学院院领导、实验教学中心领导的大力支持和帮助;还有生物基地51班的张亮、齐继艳、陈舟舟和生命基地62班的张艳红同学的积极参与,谨此深表谢意!欢迎广大师生提出宝贵意见。

编者
2010年5月
南京农业大学

第一版前言
生物化学实验技术不仅是生物化学的重要内容和理论基础,也是生物科学研究的重要方法和手段。学生通过生物化学实验,不仅可以进一步巩固生物化学的基本理论,了解实验原理,还能熟悉生物化学实验的基本方法和技术以及许多大型精密仪器的使用,从而为以后的专业课学习以及生产、科研工作打下良好基础。
《生物化学实验》供理工科高等院校的生命科学、生物技术、生物工程及农林院校的农学、林学、植保、资环、园艺、食品、理学等各专业的本科生使用,要求学生学会蛋白类、糖类、脂类、核酸、氨基酸、酶和维生素的分离提取、定量测定或定性鉴定等方法;掌握电泳、层析、离心和光谱法检测等技术;培养学生综合性、设计性实验创新能力。
本书在南京农业大学生命科学院编写的《生物化学实验指导》讲义基础上,又吸取了该校多年的教学、科研、开发工作中的经验和广大学生的建议,对原教材内容进行了必要的修改,重新编写了这本《生物化学实验》教材,并补充了许多新的实验内容,便于学生自学。我们还增设了“自行设计实验”、“综合性选做实验”和“综合性开放实验”,鼓励和培养学生自己动手、开发创新的精神。在附录中,我们还整理和翻译了有关“常用仪器性能指标及使用说明”、“缓冲溶液的配制”、“植物样品的采集、处理及保存”等内容,为从事综合性生物化学实验的师生们提供方便。
本教材多年来得到了苏业瑜、叶茂炳、周培根、徐朗莱、戚晓玉各位教授和欧瑜等老师以及生命科学院领导、实验教学中心领导的大力支持和帮助;还有生物基地51班的张亮、齐继艳、陈舟舟和王潇同学的积极参与,谨此深表谢意!鉴于作者水平有限,欢迎广大师生提出宝贵意见。

编者
2007年3月

文摘
版权页:



多组分样品在电泳分离中主要依靠两种效应:①电荷效应,即带净电荷多的蛋白质分子移动得快,反之则慢;②分子筛效应,即分子量或构型不同的蛋白质分子,通过一定孔径的胶时,受到的阻力不同,分子量小的或构型适合于通过凝胶孔径的分子泳动快,反之则慢。而对于分辨率较高的不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳而言,则还存在另一种效应——样品的浓缩效应。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳是以孔径大小不同的聚丙烯酰胺为支持物,采用电泳基质的不连续体系,即凝胶孔径的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性和电泳过程中自动形成的电位梯度的不连续性,使样品在不连续两相之间积聚浓缩成很窄的一条区带(10~cm),然后再进行电泳分离。所用的凝胶由两部分组成:一部分是分离胶,与连续电泳的胶相似,用于把蛋白质分开;另一部分是浓缩胶,它使样品压缩成很窄的一条区带。样品的浓缩效应原因是电泳基质的不连续:①由于两种凝胶孔径不同,酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时,阻力突然加大,速度变小,这样就在两层凝胶交界处使待分离的蛋白质区带变窄,浓度升高。②上层浓缩胶缓冲液pH为6.7,下层分离胶pH为8.9,两种缓冲液都是Tris—HCl,由于Cl一全部解离,它分布在整个凝胶内,蛋白质样品加在加样孔内,浸在pH8.3的Tris—甘氨酸缓冲液中,电泳一开始,有效泳动率最大的Cl—迅速跑到前面,成为快离子(前导离子);在pH6.7条件下解离度仅有0.1%~1%的甘氨酸(Gly)有效泳动率最低,跑在最后面,成为慢离子(尾随离子)。这样,快慢离子之间形成一个不断泳动的界面,在pH6.7条件下带有负电荷的蛋白质,其有效泳动率介于快慢离子之间,被夹持分布于界面附近,逐渐形成一个区带。由于离子快速向前移动,在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区,即低电导区,由于电位梯度V电流强度,和电导率S之间有如下关系:V=1/S,所以在电流恒定条件下,低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种电泳开始后产生的高电位梯度作用于蛋白质和甘氨酸慢离子,使它们加速前进,追赶快离子,本来夹在快慢离子之间的蛋白质区带,在追赶过程中被逐渐压缩聚集成一条狭窄的区带,这就是所谓的浓缩效应。当蛋白质和慢离子都进入分离胶后,pH从6.7变为8.9,甘氨酸解离度剧变,有效迁移率迅速加大到超过所有的蛋白质分子,从而赶上并超过所有的蛋白质分子,此时,快慢离子的界面跑到被分离的蛋白质之前,于是,此后的电泳过程中,蛋白质在一个均一的电位梯度和pH条件下,仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。
由以上的原理可见,聚丙烯酰胺凝胶的不连续电泳最主要的优点就是使蛋白质样品经浓缩胶后,形成紧密的压缩层进入分离胶。蛋白质各成分压缩成层,可以减少在电泳时成分间由于扩散而造成的区带相互重叠而带来的干扰,这样就提高了电泳的分辨能力。
根据国际生物化学命名委员会的定义,同工酶(isozyme或isoenzyme)是指同一种属中,由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂聚体,其分子的一级结构、理化性质和生理功能不同,而催化功能相同的多态型酶类。运用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)研究同工酶日益普及,根据酶带的变化已经成为鉴定物种、研究分类与进化以及遗传与变异的重要手段。超氧化物歧化酶(SOD)是活性氧代谢中的重要酶。植物生长过程中其活性和同工酶的变化,可以反映某一时期植物体内活性氧代谢的变化。超氧化物歧化酶同工酶由于其分子量、所带电荷和分子形状的不同,在电泳过程中泳动率也就不同,通过其特异的染色方法,最后在凝胶上能直接看到超氧化物歧化酶同工酶的酶带。

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