新生物学年鉴2013.pdf

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书籍描述

作者简介
肖 鹏,山东大学实验畸形学教育部重点实验室和山东大学医学院生物化学与分子
生物学研究所、山东省高校慢性退行性疾病的蛋白质科学重点实验室;孙金鹏,山东大学实验畸形学教育部重点实验室和山东大学医学院生物化学与分子
生物学研究所、山东省高校慢性退行性疾病的蛋白质科学重点实验室;裴 钢,同济大学生命科学与技术学院、中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞生物学国家重点实验室

目录
目录
丛书序 ········································································································································ i
前言 ·········································································································································· iii
G 蛋白偶联受体结构分析的近年进展 ···················································································· 1
肖鹏、孙金鹏、裴钢
复杂生物过程中关键节点及关键因子检测
——基于动态网络标志物的复杂疾病早期预测 ········································································· 29
刘锐、张万纬、陈洛南
肠道菌群与代谢性疾病之间的关系研究进展 ····································································· 47
赵立平、张旭、张晨虹
干细胞基础研究与转化应用研究 ························································································· 82
胡宝洋、贾云丹、李伟、刘蕾、项鹏、张映、赵同标、周琪、朱宛宛
表型可塑性研究 ··················································································································· 128
陈兵、康乐
RNA介导的DNA 甲基化 ··································································································· 156
张蘅、杨荣、朱健康
脊椎动物基因组DNA 去甲基化及其在发育中的作用 ····················································· 200
吴笛、孟安明
植物次生代谢及调控的研究进展 ······················································································· 215
方欣、杨长青、王凌健、陈晓亚
群落系统发育学研究进展 ··································································································· 266
米湘成、裴男才、马克平
生物多样性信息学研究进展与发展趋势 ··········································································· 290
许哲平、陈彬、王利松、乔慧捷、刘凤红、覃海宁、马克平

文摘
1. 前 言
1.1 GPCR在信号转导和药物发现中的重要性
  由磷脂双分子层组成的细胞膜将细胞内部物质从周围环境中独立出来,使细胞可以
在一个相对封闭的环境开展自主的生命活动。细胞内外并非完全隔绝,一方面,细胞膜
把相对有害的物质隔绝在周围环境中;另一方面,细胞需要和外界进行物质交换,并感
知外界的环境刺激,因应外界的刺激做出合适的响应。因此,细胞的跨膜信号转导在细
胞的生命活动中有重要的作用。而特征拓扑结构为7次跨膜螺旋的G蛋白偶联受体
(GPCR),在人类基因组中拥有800多个成员,是细胞膜蛋白中的最大家族,在细胞的
跨膜信号转导过程中占据核心的位置(图1)(Fredriksson et al., 2003)。
  正是因为GPCR在跨膜信号转导中的重要性,它一直以来都是药物发现的研究热
点。目前,约40%的临床处方药是直接或间接作用在GPCR或其介导的信号通路上的
(Wise et al., 2002; Katritch et al., 2012)。而对GPCR介导的信号转导机制的研究和药物
与GPCR相互作用机理的研究,因也引领了20世纪药物学的发展(肖鹏等,2012)。以
GPCR作为靶点的药物可应用于治疗涵盖了人类的多种疾病,如治疗心脏病的药物心得
安、治疗胃溃疡的药物西米替丁,以及最近成功用于糖尿病的药物利拉鲁肽(Black et al.,
1964; Guth et al., 1979; Buse et al., 2009)。
  

图1 G蛋白偶联受体介导的跨膜信号转导(修改自Rosenbaum et al., 2009)
以肾上腺素能受体激活为例,G蛋白偶联受体(GPCR)所介导的多个信号通路。β2肾上腺素能受体可以分别激
活Gs和Gi两种蛋白。Gs蛋白激活后,增加腺苷酸环化酶活性,提高细胞内第二信使cAMP浓度,升高蛋白激酶
A (PKA)的活性。蛋白激酶A在体内调控L型钙离子通道活力并负反馈调控β2肾上腺素能受体的活性。β2肾
上腺素能受体在激活过程中的构象变化激活G蛋白偶联受体激酶(GRK)。GRK催化受体磷酸化进而推动Arrestin
与受体结合。Arrestin一方面与Clathrin和AP-1相互作用从而介导受体的内吞,阻碍G蛋白结合而终止G蛋白信号;
另一方面Arrestin也可激活胞外信号调节激酶(ERK)等非G蛋白依赖的信号转导途径,独立介导GPCR下游的
信号转导
  
1.2 GPCR研究领域的发展历史及最近的突破
  从20世纪初 John N. Langley(英国)提出受体的概念开始,关于受体的研究已经
持续了130余年。最初,Langley的学生Archibald V. Hill(英国)用数学方程描述了受
体与配体作用的二元模型。此后的50多年,受体的研究主要由化学家和生理学家共同
推进。分子生物学家是在20世纪70年代开始加入对受体的研究的,延续至今并不断获
得突破。由于Robert J. Lefkowitz(美国)和Brian K. Kobilka(美国)过去40年中在
GPCR分子机制中的奠基性贡献,包括肾上腺素能受体的同位素标记、纯化和克隆,配
体-受体-效应器三级复合物模型等,以及Kobilka近些年来在GPCR结构研究方面的突
破,这两位科学家于2012年获得诺贝尔化学奖(肖鹏等, 2012)。到目前为止,GPCR
涉及的领域已经获得了10次诺贝尔奖,彰显了GPCR研究的重要性。
  虽然GPCR如此重要,但可为GPCR的机制研究奠定基础的GPCR结构生物学研
究却一直进展缓慢,主要原因是除视杆色素(rhodopsin)外,大部分GPCR蛋白的表达
丰度都很低,结构不稳定,纯化过程中蛋白的失活十分迅速。虽然牛视杆色素的晶体结
构于2000年获得了解析,但人们长时间对其他GPCR,尤其是结合可扩散配体的GPCR
的结构解析一直束手无策;GPCR与下游效应器复合物的作用机制也很难在原子分辨率
水平的结构上进行阐述。发展一种可对所有GPCR结构解析的方法,成为GPCR研究和
药物学发展的迫切需求。从Lefkowitz实验室离开并独立开展研究工作后,Kobilka进一
步发展了在GPCR第三个内环插入溶菌酶的方法;结合特异性抗体的应用,并与
Raymond C. Stevens(美国)合作,加入了脂立方结晶技术,终于为所有GPCR的结构
解析开拓了一条道路,带来了这几年GPCR结构生物学突破性的进展。本文将重点介绍
GPCR结构生物学的进展和目前的研究热点。
2. GPCR的结构研究进展
2.1 GPCR的研究初期:发现、初步纯化和克隆
  早在受体的概念提出之前,作为GPCR超家族成员之一的视杆色素就已经在19世
纪70年代被人们发现。视杆色素在视网膜中大量表达,相对其他GPCR较易获得和纯
化。George Wald(美国)从视杆色素中分离了视黄醛,并因此获得了1967年诺贝尔生
理学或医学奖;但直到20世纪80年代前,从来没有人把感光系统与体内激素的生理作
用联系起来(Palczewski, 2006)。受体的概念由英国药学家John Langley在20世纪初提
出。Langley在研究胆碱能药物和箭毒对骨骼肌和唾液腺作用的机制时,首次明确提出
了“感受物质”(receptive substance)这一概念。他推测“感受物质”可以通过某种独
特的方法与化学物质或神经刺激相结合,并且可以引起“主要物质”(chief substance)
功能的改变(Langley, 1905)。该”受体-效应物”理论的提出在当时并未获得广泛的认可,
反而受到不少质疑(Lefkowitz, 2013)。尽管如此,配体和受体互作理论在1920~1970年
这半个世纪之间在Henry H. Dale(英国)、Alfred J. Clark(英国)、John H. Gaddum(英
国)、Robert P. Stephenson(英国)、Raymond P. Alquist(美国)、Everhardus J. Ari?ns(荷
兰)、James W. Black(苏格兰)、Robert F. Furchgott(美国)和Heinz O. Schild(英国)
等人的努力下得到了充分的发展。20世纪60年代是GPCR研究历史上的一个重要时期,
Earl W. Sutherland(美国)对腺苷酸环化酶及其产物“第二信使”——cAMP的研究显
示,cAMP介导激素引起的细胞响应,很大程度上暗示了受体是物理存在的,而不仅仅
是一个概念。然而受体本身是什么物质,依然是一团疑云,充满争议。诺贝尔奖得主
Sutherland就曾一度认为腺苷酸环化酶本身就是受体(Robison et al., 1967)。当时在哥伦
比亚大学医学院做住院医生的Lefkowitz在这时加入到发现受体的研究当中(Snyderman,
2011)。Lefkowitz应用放射性同位素125I和3H分别标记了促肾上腺皮质激素(ACTH)
和去甲肾上腺素(NA),从而发现在细胞表面上存在可与激素结合的受体(Lefkowitz et
al., 1970; Lefkowitz and Haber, 1971),而且激素与受体的结合与腺苷酸环化酶的激活是
两个独立的过程(Lefkowitz et al., 1970)。
  虽然同位素标记实验证明了配体(激素)可以直接与膜上的蛋白质选择特异性的相
互作用,但这些与配体相互作用的膜蛋白是否就是传递配体信号的物质,还需要进一步
证实。分离纯化并获得高纯度的受体,对受体进行性质鉴定和功能分析是证明受体客观
存在的最好证据。然而由于大部分GPCR在细胞内的丰度极低,其纯化需要至少100 000
倍的富集,又因其内部结构的不稳定性,而非常易于失活,因此早期GPCR的纯化工作
十分困难(Lefkowitz, 2013)。Lefkowitz在早期纯化β2肾上腺素能受体蛋白时,尝试了
多种方法。他的研究组发现,去污剂Lubrol-PX和deoxycholate的应用可显著提高β2
肾上腺素能受体蛋白的可溶性。针对GPCR蛋白的低丰度和与配体特异性的结合这些性
质,Lefkowitz课题组制作了亲和层析柱,在琼脂糖的侧链上人工加入长度为30?的糖
链,并在链的末端与去甲肾上腺素偶联。这些方法的联合使用,使他们获得了较纯的β2
肾上腺素能受体蛋白,纯度提高了500~800倍(Lefkowitz et al., 1972)。该方法的成功
为纯化其他扩散性配体GPCR拓宽了道路。Lefkowitz课题组进一步应用肾上腺素能受体
的拮抗剂alprenolol偶联的琼脂糖作为亲和层析柱的介质,解决了去甲肾上腺素易氧化
的问题,建立了更有效的适合大规模纯化受体蛋白的方法(Caron et al., 1979)。随后,
除β2肾上腺素能受体外,当时已知的β1、α2和α1肾上腺素能受体同样被成功纯化。对
纯化后的受体研究表明,上述肾上腺素能受体均为高度疏水的糖蛋白单体,分别识别特
异的扩散性配体(Caron et al., 1979; Regan et al., 1982; Shorr et al., 1982; Benovic et al.,
1984; Lomasney et al., 1986; Repaske et al., 1987)。GPCR 纯化方法的初步建立为其下一
步的分子克隆和结构解析奠定了基础。
   因在视网膜中的高丰度表达和结构的稳定性,GPCR家族成员中的视杆色素的相
关研究一直走在其他GPCR研究的前面。然而,在Lefkowitz和Kobilka推断肾上腺素
能受体和视杆色素同属于GPCR超家族之前,没有人将二者紧密的联系到一起。依据视
杆色素蛋白测序的结果,在1983年和1984年,牛和人视杆色素蛋白编码基因被成功克
隆(Nathans and Hogness, 1983; Nathans and Hogness, 1984)。序列分析显示视杆色素蛋
白与古细菌Halobacterium halobium中感光的质子传递蛋白bacteriorhodopsin均具有7
次跨膜区域(Henderson and Unwin, 1975; Ovchinnikov, 1982; Hargrave et al., 1983)。因此,
7次跨膜结构一开始被认为是感光蛋白的特征结构,而没有人把7次跨膜与激素受体关
联起来。基于Lefkowitz研究组纯化的β2肾上腺素能受体蛋白的序列分析结果,以及
Kobilka大胆的应用基因组DNA进行克隆的方法,1986年,第一个扩散性配体的受体
编码基因被成功克隆(Dixon et al., 1986)。对编码基因序列的分析发现,β2肾上腺素能
受体具有7个富含脯氨酸和芳香族氨基酸的疏水跨膜区域,蛋白N端含有多个糖基化位
点而C端具有多个磷酸化位点(Dixon et al., 1986),这些结构特点与视杆色素蛋白结构
类似。更重要的是,二者均通过与G蛋白偶联发挥功能(Gilman, 1984; Stryer, 1986)。
Lefkowitz和Kobilka据此提出了具有7次跨膜结构的G蛋白偶联受体家族的概念
(Dohlman et al., 1987)。此后的短时间内,包括人类β1、β2、血小板α2在内的肾上腺素
能受体和毒蕈硷乙酰胆碱受体(muscarinic acethylcholine receptor)等一系列受体编码基
因或cDNA被成功克隆(Kubo et al., 1986; Frielle et al., 1987; Kobilka et al., 1987; Kobilka
et al., 1987; Fargin et al., 1988; Buck and Axel, 1991)。7次跨膜的GPCR家族的概念也带
来首个“孤儿受体”的发现(Kobilka et al., 1987)。这个孤儿受体随后被证实为5羟色胺
(5HTA1A)受体(Fargin et al., 1988),成为首个“脱孤”受体(肖鹏等, 2012)。
  随着人类基因组计划的开展和完成,我们发现人类GPCR超家族包含超过800个成
员。系统进化分析确定G蛋白偶联受体可分为5大类:类视杆色素受体亚家族、类Secretin
受体亚家族、Adhesion受体亚家族、Glutamate受体亚家族和Frizzled/Taste2受体亚家族
(Fredriksson et al., 2003)。类视杆色素亚家族成员众多,约占已知GPCR的80%以上,
是目前研究比较集中的一类。现代分子生物学技术可以使大部分GPCR获得外源性的过
表达,结合组合化学方法,许多配体与GPCR的相互作用也得到深入的研究。然而,由
于膜蛋白纯化和结晶的技术瓶颈,GPCR的结构生物学研究进展一直相对缓慢,为基于
GPCR进行药物设计和阐明GPCR的工作机制带来很大障碍,直到Kobilka和Stevens
近年取得开创性的突破。
2.2 GPCR结晶学发展以及技术突破
  作为重要的细胞跨膜信号转导分子,人们一直试图了解GPCR将细胞外信号传递至
细胞内部的作用机制,这就必然需要获得GPCR与上下游分子相互作用的结构信息。蛋
白质晶体结构可以提供原子层级的高分辨率结构信息,从而回答配体与受体是如何结合
的、配体如何诱导受体产生特异性的构象并传递到下游信号分子、受体的构象改变又如
何决定下游信号分子的构象等问题。这些信息对人类科学和药物发展具有重大价值。除
视杆色素之外,几乎所有的GPCR家族成员在细胞内的表达丰度都很低,易被降解而失
活;GPCR成员为膜蛋白,具有复杂柔韧的跨膜疏水性结构,所以不易结晶;GPCR构
象始终处于不断变化的过程中,十分不稳定;这些特点成为制约GPCR家族成员结晶的
主要因素(Lefkowitz et al., 2008)。因此解析GPCR家族成员高分辨率的晶体结构一度
成为在结构生物学和药物学研究中的重大挑战,在很大程度上限制了我们对GPCR功能
的研究,阻碍了新药的开发,直到最近获得突破。
  视杆色素和β2肾上腺素能受体(β2-adrenergic receptor)是两个被研究得最多的
GPCR。因为视杆色素的高表达丰度,GPCR早期的结构生物学研究主要集中于视杆色
素。在分离的视杆细胞外段中,90%的蛋白质都是视杆色素。纯化后的视杆色素在避光
条件下及温和的去污剂中可长期保持稳定,稳定性达数周之久。所以不需要复杂的纯化
技术和外源性的重组蛋白表达,人们可以非常容易的获得足够的视杆色素蛋白进行结构
生物学分析。在编码视杆色素的基因被克隆之前,人们在1975年就观察到细菌感光的
质子传递蛋白bacteriorhodopsin的电镜图像(Henderson and Unwin, 1975),在1982年就
已经获得了牛视杆色素的晶体(Corless et al., 1982)。即使这样,视杆色素的结构分析的
进展也比较缓慢。在获得二维晶体结构十多年后,Gebhard F. X. Shertler(奥地利)和
Paul A. Hargrave(美国)等才用电镜的手段获知视杆色素7次跨膜区域的排布模式和方
向(Schertler et al., 1993; Unger and Schertler, 1995; Unger et al., 1997)。2000年,Krzysztof
Palczewski(波兰)等在尝试多种去污剂后,利用octyl-β-glucoside和heptanetriol成功辅
助结晶了牛视杆色素蛋白,并通过X射线衍射解析获得了第一个GPCR的晶体结构,
分辨率为2.8?(Palczewski et al., 2000)。2004年,去污剂n-octyltetraoxyethylene(Li et al.,
2004)、heptylthioglucoside(Okada et al., 2004)的应用使牛视杆色素蛋白晶体结构分辨
率提高到了2.2?。在这一时期内,牛视杆色素蛋白是唯一获得原子层级的高分辨率结构
的GPCR家族成员(Palczewski et al., 2000; Teller et al., 2001; Okada et al., 2002; Li et al.,
2004; Okada et al., 2004)。

内容简介
《新生物学年鉴2013》为一本由《新生物学丛书》10位编委组稿并把关、
各地大学及研究所骨干研究人员撰写,反映近年来分子生物学、生物化学、
细胞生物学等最前沿领域的10篇文章组成的文集。这些文章的内容均为撰写
者的最新研究成果,因此年鉴可以在一定程度上体现出我国生物学领域的发
展现状。
  去年的《新生物学年鉴2012》在社会上引起了较好的反响。今年的《年
鉴2013》秉承了去年的制作理念,并扩充了涉及的生物学子学科,有更多的
中国生物学研究领域的中坚力量参与撰写,务求使相关领域的研究人员获得
第一手权威的综述性文章。

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